ExpressPlex™ Library Prep Kit

Le librerie sono state preparate come descritto sopra, sequenziate (MiSeq Nano; 2 x150) e de novo assemblate utilizzando la pipeline di assemblaggio del plasmide SNAP di seqWell. La corsa di sequenziamento è stata sottoposta a downsampling a 1.000 o 500 coppie di letture medie per campione per identificare gruppi di plasmidi circolari privi di errori. Anche a sole 500 coppie di lettura medie, tutti i campioni ExpressPlex hanno generato assembly circolarizzati corretti. Allo stesso numero di letture, tuttavia, Nextera XT (reazioni complete e ¼) ha fallito l’8-10% dei tentativi di assemblaggio. Dato il robusto bilanciamento delle letture e il minor numero di letture necessarie per generare assemblaggi corretti, gli utenti di ExpressPlex possono eseguire il multiplexing di un numero maggiore di campioni su una singola corsa Illumina o utilizzare una cella a flusso di capacità inferiore, riducendo così il costo del sequenziamento per plasmide.

20 ampliconi mappati in modo univoco sono stati generati dal DNA lambda. Gli ampliconi sono stati utilizzati in modo combinatorio come input nella preparazione della libreria ExpressPlex in modo tale che ogni campione sia composto da 2 ampliconi lambda e ogni pozzetto contenga una combinazione univoca di ampliconi. L’input del campione è stato mantenuto a 16 ng e sono stati utilizzati 15 cicli di PCR durante la preparazione della libreria. Dopo il sequenziamento, le letture demultiplexate sono state mappate sul genoma lambda e contrassegnate come target (combinazione di ampliconi prevista) o fuori target per ciascun pozzetto. Tutti i pozzi hanno un tasso on-target >99% (figura sopra) con un tasso medio on-target del 99,XX%. Il sequenziamento dell’amplicone con EP consente una preparazione efficiente di un massimo di 1536 ampliconi multiplexati su una singola corsia, consentendo applicazioni ad alto rendimento senza timore di index-hopping o chimere PCR.