StabyCloning™

Il kit  StabyCloning™ è un kit easy-to-use disegnato per un rapido ed efficiente cloning di prodotti PCR blunt. Alla fine di un processo di cloning molto rapido (meno di 1 ora incluso plating), mentre il background è prossimo allo zero, il prodotto di PCR viene clonato in un singolo orientamento e perfettamente stabile. Alla fine l’inserto stabilizzato è facilmente esportabile in qualsiasi altro vettore. VELOCE: Legame + transformazione + plating in 1 ora PRECISIONE: Vectori senza inserto vengono eliminati (background < 1 %) e il frammento di DNA è correttamente orientato nel vettore MOBILITA’: L’esportazione [ cassetta di stabilizzazione + inserto] è facilmente fattibile in altri vettori I ricombinanti sono tutti cloni indipendenti (plating diretto) NO colonie “satellite” osservate anche dopo incubazione prolungata NO rischio di background quando si utilizzano plasmidi AmpR come templati PCR I plasmidi ricombinanti sono perfettamente stabilizzati SENZA USO DI ANTIBIOTICI Il sistema può essere utilizzato in qualsiasi mezzo di coltura

Il batterio CYS21, incluso in StabyCloning™ kit, contiene nel suo cromosoma un gene per un veleno batterico naturale (codificante la proteina CcdB). Questa proteina CcdB è tossica solo negli enterobatteri (E. coli, Salmonella). Un gene antidoto (ccdA), inattivo,è presente nel plasmide vettore (pSTC1). Il vettore è linearizzato alla fine del gene antidoto troncato. Le estremità del vettore sono “blunt ends”. Quando una sequenza di 14 bp (codificante gli ultimi 4 codoni e ul codone stop del gene antidoto) viene aggnta all’estremità 5’-end del frammento di DNA che deve essere clonato, la fusione di questa sequenza con il gene troncato riattiva il gene antidoto che così codifica la proteina attiva (CcdA) in grado di contrastare l’azione del veleno. La sequenza di 14-bp è incorporata nel frammento di DNA utilizzando un primer di PCR modificato. Come illustrato di seguito, il processo permette la selezione dei (i) plasmidi ricombinanti che incorporano il frammento d’interesse, e (ii) l’orientamento del frammento d’interesse (solo uno dei due possibili orientamenti riattiverà il gene ccdA attivo, non troncato).

Utilizzando StabyCloning^™ kit, la completa procedura di cloning avviene in 1 ora incluso il plating. Tutte le colonie sono indipendenti perchè NON è richiesta fase di crescita tra trasformazione e plating. Tutti i batteri che crescono contengono il vettore con l’inserto nel corretto orientamento. La riattivazione del gene attivo ccdA permette la selezione dei ricombinanti e anche la stabilizzazione del plasmide nella popolazione batterica: se qualche batterio perdesse il vettore, sarebbe distrutto dall’azione del veleno batterico. Dopo il cloning di un inserto, è facile esportare la cassetta di stabilizzazione (gene antidoto) insieme all’inserto utilizzando siti di restrizione nel vettore. L’inserzione in un’altro vettore può essere selezionata utilizzando i batteri CYS21 e le proprietà dell’antidoto.

Download brochure

The StabyCloning™ kit contiene plasmide DNA linearizzato del vettore pSTC1.3 vector, batteri competenti (chemically o electro), ligasi, medium di rigenerazione, primers di sequenza, controllo positivo e manuale d’istruzione. Batteri competenti addizionali possono essere acquistati separatamente.